Растително-почвени взаимодействия – Научна група 2
Научна група
Разработване на протоколи за микроразмножаване на застрашени от изчезване, традиционни и нетрадиционни за България лечебни растения
Разработени са ефективни методи за микро размножаване и адаптиране в полски условия на исоп (Hyssopus officinalis L.), гръцки риган (Origanum heracleoticum L.), колеус (Coleus forskohlii Briq) и физалис (Physalis peruviana L.). Растенията са култивирани на MS среда, обогатена с BAP, TDZ или зеатин в различни концентрации (0.5 mg L-1 и 1.0 mg L-1) и 0.1 mg L-1 IBA за период от четири седмици. За индуциране на корени, формираните микро стъбла се отрязват и прехвърлят на среда за вкореняване – ½ MS, обогатена с 0.1 mg L-1 IBA, IAA или NAA и 20 g L-1 захароза. Окислителният стрес, предизвикан от микроразмножаването, активира ензимни и неензимни компоненти на антиоксидантната защитна система на растенията. Използваните за микроразмножаването растежни регулатори повлияват по различен начин антиоксидантната система на изучаваните растения.
Исоп (Hyssopus officinalis L.)
Разработен е ефикасен метод за микро размножаване на исоп (Hyssopus officinalis L.) с използване на млади стъблени връхчета. Растенията са култивирани на MS среда, обогатена с BAP, TDZ или зеатин в различни концентрации (0.5 mg L-1 и 1.0 mg L-1) и 0.1 mg L-1 IBA за период от четири седмици. Размножаването на исопа до голяма степен зависи от типа на цитокинина и ауксина. Най-голям брой стъбла, дължина на стъбло, свежо и сухо тегло са установени при 1.0 mg L-1 BAP и 0.1 mg L-1 IBA. За индуциране на корени, формираните микро стъбла се отрязват и прехвърлят на среда за вкореняване – ½ MS, обогатена с 0.1 mg L-1 IBA, IAA или NAA и 20 g L-1 захароза. Използването на 0.1 mg L-1 IBA води до най-добро вкореняване, най-голям брой корени и най-голяма дължина на корените след четири седмици култивиране. Голяма част от получените растения са успешно адаптирани ex vitro върху смес от почва:пясък:перлит (2:1:1, v/v/v) с 85% преживяемост. Използваните за микроразмножаването на исоп растежни регулатори повлияват антиоксидантната система на растението. Антиоксидантната защита на микроразмножените растения исоп, определена чрез активностите на антиоксидантните ензими (супероксид дисмутаза, каталаза, аскорбат пероксидаза и гваякол пероксидаза) и съдържанието на вторични метаболити с антиоксидантен потенциал (феноли, флавоноиди, водно- и мастно- разтворими антиоксиданти) зависи от вида на използвания цитокинин.
Микроразмножаване на исоп (H. officinalis L.) на MS среда, съдържаща: a) 1.0 mg L-1 BAP и 0.1 mg L-1 IBA; b) 1.0 mg L-1 TDZ и 0.1 mg L-1 IBA; c) 1.0 mg L-1 Zeatin и 0.1 mg L-1 IBA.
Вкоренени растения исоп (H. officinalis L.) на ½ MS среда, обогатена с: a) 0.1 mg L-1 IBA; b) 0.1 mg L-1 NAA; c) 0.1 mg L-1 IAA; d) Ex vitro адаптирани растения.
Направено е сравнение на биологично активните вещества, в това число и на етеричните масла, представени в растения исоп, отгледани от семена, ин витро размножени и адаптирани в полски условия и събрани от естествените местообитания (местността Бучин проход, община Годеч – западна България, GPS data: 42°58ʹ6.67ʺN/ 23° 8ʹ51.75ʺE, 780 м надморска височина). Съдържанието на изследваните неензимни нискомолекулни метаболити с антиоксидантен капацитет, феноли и флавоноиди, е най-високо в цветовете и листата на ин витро размножените растения. Екстрактите от листа и цветове на трите групи растения исоп се различават по техния антиоксидантен потенциал, като най-високи стойности са отчетени при растенията отгледани ин витро. Най-високи концентрации на етерични масла са установени при растенията, взети от естествените им местообитания. Етерично масленият добив от ин витро отгледаните растения е приблизително два пъти по-висок от този на растенията, отгледани от семена.
Исоп (Hyssopus officinalis): ин витро размножени растения (a), растения отгледани от семена (b) и растения от естественото им местообитание (c).
Бял риган, Гръцки риган (Origanum heracleoticum L.)
Проведено е изследване за разработване и прилагане на протокол за микроразмножаване на Гръцки риган, от стъблени връхчета като експланти. Растенията са култивирани на MS среда, съдържаща различни концентрации (0.5 или 1.0 mg L-1) на растителни растежни регулатори – BAP, TDZ и зеатин. Формирането на стъбла от връхни експланти е най-високо на MS среда с добавен 1.0 mg L–1 зеатин. Това е най-ефективната среда за образуване на стъбла, с най-голям среден брой стъбла – 3.8 и с най-голяма средна дължина на стъблата – 3.9 см. Така получените стъбла са прехвърлени на ½ MS среда, съдържаща три различни ауксина: IBA, IAA и NAA (0.1 и 0.5 mg L-1) с цел формиране на корени. Най-ефективно коренообразуване е постигнато на ½ MS среда, съдържаща 0.5 mg L-1 IBA. Вкоренените растения най-добре се адаптират върху смес от торф и перлит в съотношение 2:1 (v/v). Най-голям брой и най-високи стъбла за растение съответсват на най-висока продукция на метаболити с антиоксидантен потенциал, като феноли и флавоноиди, както и на най-висок желязоредуциращ антиоксидантен потенциал.
Микроразмножаване на Гръцки риган (O. Heracleoticum): a) ин витро размножени стъбла на среда с 500 mg L-1 CaCl2; b) ин витро размножени стъбла на среда с 1.0 mg L-1 зеатин след три седмично култивиране; c) ин витро размножени стъбла на среда с 1.0 mg L-1 BAP след триседмично култивиране; d) вкоренени растения на среда с 0.5 mg L-1 IBA след четириседмично култивиране; e) вкоренени растения на среда с 0.5 mg L-1 NAA след четириседмично култивиране; f) ex vitro адаптирани растения след осем седмично култивиране.
Направено е сравнение между химичния състав на етеричните масла, събрани от надземните части на растения Гръцки риган, както и на антиоксидантните характеристики на екстракти от листа и цветове на растения, събрани от различни естествени популации в България (Кресненско дефиле и Родопи) по време на периода на цъфтеж с тези на ин витро размножени и адаптирани на полето растения.
За микроразмножаването са използвани експланти от диворастящи растения от Горна Брезница (Кресненско дефиле). Ензимният антиоксидантен потенциал, характеризиран посредством активността на супероксид дисмутазата, каталазата, гваякол пероксидазата и аскорбат пероксидазата, както и неензимния антиоксидантен капацитет, характеризиран посредством съдържание на общи феноли, флавоноиди, водно- и мастно- разворими антиоксидантни метаболити е най-висок в цветовете и листата на ин витро размножените и адаптирани на полето растения. Стойностите на антиоксидантна активност е много подобна на тази при растения, събрани от Рафтинг център и Горна брезица, намиращи се в Кресненското дефиле.
Идентифицирани са четиридесет и пет вещества в етеричното масло на Гръцки риган, събран от негови естествени популации. Въз основа на етерично масления състав, в частност съдържанието на карвакрол и тимол, растенията Гръцки риган от всички изследвани естествени популации от България, принадлежат към карвакрол хемотип. Общото съдържание на монотерпени не се променя при микроразмножаването на Гръцкия риган. Повишават се само стойностите на сесквитерпените.
Колеус (Coleus forskohlii Briq)
Създаден е лесен протокол за ин витро вкореняване на важното медицинско растение Колеус (Coleus forskohlii Briq), с високо съдържание на вторични метаболити с антиоксидантна активност. За ин витро покълване на семена от Колеус е използвана MS среда с витамини, с добавени 0.4 mg L-1 Гиберелинова киселина (GA3). Получените стъбла са култивирани на ½ MS среда, съдържаща IBA или IAA в концентрации 0.1 и 0.5 mg L-1 . Най-добро вкореняване (95%), със средни стойности 9.2 корена на експлант, максимални дължина на корени (5.1 см) и свежо тегло на корени (0.085 г) са наблюдавани на ½ MS среда с 0.1 mg L-1 IBA след триседмично култивиране. Растенията са успешно адаптирани екс витро, с 93.3% преживяемост, на смес от почва, торф и перлит (2:1:1, v/v/v). Активността на антиоксидантните ензими (cупероксид дисмутаза, каталаза, аскорбат пероксидаза и гваякол пероксидаза) е най-висока при използване на IBA при микроразмножаването на Колеус. Ауксините, използвани при микроразмножаването на Колеус повлияват синтезата на вторични метаболити. ½ MS среда за култивиране с 0.5 mg L-1 IAA води до най-високо съдържание на общи феноли и флавоноиди, както и най-висока обща антиоксидантна активност (free radical scavenging capacity and ferric reducing antioxidant power). Резултатите показват, че органогенезата е сложен биологичен процес, който включва низходяща регулация на растителната ензимна и неензимна антиоксидантна защитна система, която играе важна роля по време на органогенезата.
Микроразмножаване на Coleus forscohlii: a) образуване на прорастъци на MS среда с 0.4 mg L-1 GA3 и 1.0 mg L-1 CaCl2; b) вкореняване на ½ MS среда с добавени 0.1 mg L-1 IBA; c) и d) вкореняване на ½ MS среда с добавени 0.1 mg L-1 IAA; e) и f) ex vitro адаптирани растения.
Физалис (Physalis peruviana L.)
Семена от Физалис под формата на сегменти са използвани като експланти, култивирани на MS среда с добавени различни концентрации растителни растежни регулатори – BAP, зеатин и TDZ. Най-голям брой стъбла на експлант (6.6) и най-голяма дължина на стъблата (1.5 см) са отчетени на среда с 1.0 mg L-1 TDZ след пет седмична култивация. Ин витро получените стъбла формират корени за период от две седмици на ½ MS среда с един от двата ауксина: IBA или IAA в концентрации 0.1 mg L-1 и 0.5 mg L-1. Най-добро вкореняване на растенията е постигнато на ½ MS среда с 0.1 mg L-1 IBA (със среден брой корени на експлант – 12.1 и средна височина на стъблото 5.2 см) и с 0.1 mg L-1 IAA (със среден брой корени на експлант – 10.4 и средна височина на стъблото 7.3 см) за четири седмици. Протоколът за микроразмножаване се характеризира с бързо намножаване на стъблата и лесно последващо вкореняване. Намножените и вкоренени растения са успешно адаптирани, с 95% преживяемост, след два месеца в условия екс витро.
Ин витро вкореняване на физалис (Ph. Peruviana L.): a) ½ MS среда с 0.1 mg L-1 IBA; b) ½ MS среда с 0.5 mg L-1 IBA; c) ½ MS среда с 0.1 mg L-1 IAA; d) ½ MS среда с 0.5 mg L-1 IAA след четири седмично култивиране.
Окислителният стрес, предизвикан от микроразмножаването, активира ензимни и неензимни компоненти на антиоксидантната защитна система на Физалиса. Най-високи активности на ензимите супероксид дисмутаза, каталаза, аскорбат пероксидаза и гваякол пероксидаза са измерени при вариантите с най-ниски концентрации на BAP, зеатин и TDZ.
Отчетени са разлики в съдържанието на вторични метаболити, предизвикани от използваните растежни регулатори и в двете изследвани концентрации. По-високата концентрация на цитокинини повишава общата антиоксидантна сила, измерена посредством методите DPPH и FRAP при растения Физалис.
